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超微量分光光度计可用于核酸和蛋白质的定量

发布时间:2019-05-10      点击次数:718
     分光光度计是运用分光光度法对有机物开展酶联免疫法定量分析的设备。因为核酸,蛋白酶联免疫法及其病菌生长溶度的酶联免疫法样本量不大,因此超微量分光光度计应运而生。
    核酸的定量是超微量分光光度计使用频率很高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链DNA、双链DNA,以及RNA。核酸的吸收峰的吸收波长260nm,每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应消光因子。如:1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。除了核酸浓度,分光光度计显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。
    比色法蛋白质定量,蛋白质通常是多种蛋白质的化合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry等几种方法。BCA是一种较新的、更敏感的蛋白测试法,要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+,后者与BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系*,反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法,操作简单,敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

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